木薯MeCREB基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和优化

本研究以木薯为材料, 通过RT-PCR克隆出了MeCREB基因, 核酸序列分析表明, 所克隆的基因与phytozome数据库收录的MeCREB基因 (Manes.04G058300.1) 序列基本一致.MeCREB基因全长968 bp, 其中开放性阅读框 (ORF) 为747 bp, 编码248个氨基酸, 预测得出MeCREB蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白, 编码蛋白质的分子量为26.26 kD, 理论等电点为5.99, GRAVY为-0.667.构建MeCREB-pGEX-6p-1表达载体, 在大肠杆菌中进行诱导表达, 并对影响重组蛋白表达的4个主要因素 (诱导温度, 诱导起始菌量, IPTG浓度及诱导时间) 进行优化, 确定GST-MeCREB融合蛋白的最适表达条件.结果表明:重组工程菌生长至OD600=0.8时加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG, 在28℃下诱导6 h, 最适合GST-MeCREB融合蛋白的表达.本研究为高效诱导获得GST-MeCREB融合蛋白用于下游实验提供了最优方案, 并为进一步研究MeCREB基因的生物学功能奠定了基础.