中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建

CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用.基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用.本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA) gRNA (guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN 19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly(R) Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA 1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA 1-gRNA载体.根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体.p201N-Cas9-CESA 1-gRNA载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义.