梨火疫病菌Sec依赖分泌蛋白EAMY_3046的鉴定及其原核表达

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)是我国进境植物检疫性有害生物,针对其开展病原生物学研究,以及建立准确、快速、灵敏的检测方法至关重要.本研究从梨火疫菌株DSM 17948克隆了EAMY 3046蛋白的编码基因Ea3046.该基因全长660 bp,编码220个氨基酸(amino acid,AA).利用生物信息学与大肠杆菌碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,PhoA)检测体系,明确EAMY_ 3046蛋白具有Sec依赖分泌特性,其N-端17个氨基酸为信号肽(signal peptide,SP),C-端为成熟蛋白,包含203个氨基酸,命名为mEa3046.将DSM 17948菌悬液接种梨幼果,分别在O、8、24 h取样,提取总RNA,进行实时荧光定量PCR分析,结果显示Ea3046在梨火疫病菌侵染寄主植物过程中表达量显著上升,在8h和24h分别上调2.27倍和1.68倍.此外,构建原核表达载体pET-mEa3046,导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导16h后,mEa3046在15℃条件下的表达量高于其在37℃的表达量,且蛋白以包涵体形式存在;利用Ni-IDA亲和层析纯化目标蛋白,经SDS-PAGE分析表明mEa3046蛋白纯化成功.上述研究为EAMY 3046抗体制备奠定了基础.