基于多反应监测质谱技术的水稻叶片蛋白绝对定量方法

[目的]建立水稻叶片蛋白的多反应监测(MRM)质谱绝对定量方法.[方法]水稻叶片蛋白经含1.0％十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐(PBS)缓冲液提取,丙酮沉淀除杂纯化、胰蛋白酶消化,酶解液经液相色谱分离,MRM质谱监测,外标法定量.[结果]向提取缓冲液中加入1.0％SDS可增强水稻叶片中16种靶蛋白和总蛋白质的提取效果;不同有机试剂处理,总蛋白质沉淀量存在显著差异(P<0.05),沉淀能力从强到弱依次为乙腈>丙酮>异丙醇>甲醇>乙醇;对于16种目标蛋白,总体以丙酮沉淀效果最好,其次是异丙醇和乙腈,甲醇和乙醇效果较差.该方法线性范围均达到3个数量级,定量限为0.1～2.5 nmol/L,灌浆期16种水稻叶片蛋白质含量为6.0～2818.1μg/g,相对标准偏差均小于14％.[结论]SDS可显著提高水稻叶片蛋白提取效果,采用丙酮或乙腈可获得较好的蛋白沉淀效果,但不同蛋白质略有差异.结合MRM质谱监测技术可实现水稻叶片蛋白的绝对定量,方法线性范围宽、敏度高、重复性好.