甘蓝MLPK的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立

M-位点受体激酶(MLPK)是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件,其参与自交不亲和反应的分子机制尚不明确.为了分离与MLPK相互作用的蛋白,在分析了MLPK功能域的基础上采用PCR技术扩增了MLPK激酶结构域编码序列(记为MLPKK),通过体外定点突变技术构建了两种MLPK失活突变体(记为mlpkl和mlpk2),然后以pET43.1a为载体构建了原核表达质粒pET43.1a-MLPKK、pET43.1 a-mlpk1和pET43.1 a-mlpk2,并进行了原核表达和纯化.纯化的融合蛋白pET43.1a-MLPKK、pET43.1 a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育,孵育后利用融合蛋白序列中的6× His标签与Ni+结合的特性,钓取MLPK的互作蛋白,建立了分离MLPK互作蛋白的新方法.孵育产物经SDS-PAGE电泳显示,与两个突变体蛋白泳道对比,在pET43.1a-MLPKK与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与MLPK互作的蛋白条带,这为后续互作蛋白质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持.