农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系

[目的]优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础.[方法]以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基.在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性.以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L16(45)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系.使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验.[结果]再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS +0.27 μmol·L-1NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA,诱导率为83％±10.0％;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0.054μmol·L-1 NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA,平均伸长长度为(2.47± 1.33) cm.抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L-1,筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L-1.转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天.使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽;GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因.[结论]杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0.27 μmol·L-1NAA+4.4 μmol·L-16-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0.054 μmol·L-1NAA+4.4 μmol·L-16-BA.农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0.054 μmol·L-1NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA+200 mg·L-1Cef+ 70 mg·L-1Km .利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中.