桑树MLX56基因家族特性、克隆及表达分析

【目的】桑树乳胶蛋白基因在抗虫防御过程中起着重要的作用。从桑树基因组数据库中鉴定桑树MLX56基因家族，并进行基因进化、基因结构及基因的表达分析，为桑树 MLX56基因的功能研究及利用奠定基础。【方法】利用桑树基因组数据库，采用生物信息学方法，分析桑树 MLX56基因家族结构及进化关系，并对 MLX56基因家族成员进行鉴定；利用 MEGA4.1软件进行系统进化树分析；通过半定量 RT-PCR 技术研究 MLX56基因在桑树不同种及不同组织之间的表达水平，构建原核表达载体 pET-28a-MLX56-6，并将其转入大肠杆菌 BL21(DE3)中， IPTG诱导融合蛋白表达，分别收集不同诱导时间段的菌液，SDS-PAGE 检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段的菌液进行超声破碎，SDS-PAGE检测目的蛋白的可溶性；利用 Western Blot印迹验证目的蛋白的表达。并研究该基因对大肠杆菌生长速率的影响。【结果】利用桑树基因组数据库，鉴定6个 MLX56家族基因，该家族基因含有2个几丁质结合域，且都含有信号肽，属于分泌蛋白。此外还克隆到1个新的 MLX56基因，命名为 MLX56-7(GenBank登录号为 KJ496133)。系统进化树显示桑树 MLX56基因与西洋接骨木类橡胶蛋白同源性最高，同源性达66%，与茶树几丁质酶、葡萄几丁质酶同源性较低，同源性分别为49%和48%。半定量 RT-PCR 分析表明， MLX56-1，MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6和 MLX56-7在桑树不同种中均有表达，组织表达特异性分析表明MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6和 MLX56-7基因在广东桑‘桂优62号’各个组织中都有表达，MLX56-1基因仅在叶柄及茎中表达，MLX56-3基因在桑树不同种及广东桑‘桂优62号’各个组织中都没有检测到表达。原核表达结果表明，MLX56-6蛋白在终浓度为0.5 mmol·L －1的 IPTG 诱导下成功表达；融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在； Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌 BL21(DE3)中表达了1个分子量为56 kDa的蛋白。但在诱导表达过程中，大肠杆菌 BL21(DE3)生长速率受到 MLX56-6基因的抑制。【结论】MLX56基因家族在桑树进化过程中发生了基因的重复，且在结构上出现了分化。根据 MLX56基因家族的蛋白及结构特征，该基因家族可能属于具有凝集素活性的几丁质酶。MLX56基因在桑树不同种及不同组织中的表达存在差异，暗示这些基因在桑树不同种及不同组织中的功能存在一定差异。