一种犬细小病毒基因工程抗体的制备

本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒(canine parovirus,CPV)基因工程抗体并检测其生物活性.通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型;采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性;经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列,将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接;分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H,将载体共转染HEK-293细胞,采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性;采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量;用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定;间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性.结果 显示,CPV单克隆抗体亚型为IgG2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×1011L/mol,只与CPV VLPs发生反应.琼脂糖凝胶电泳结果显示,试验成功构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H;HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶24和1∶26,中和试验结果显示,HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290;鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L,SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带,表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化.间接免疫荧光检测结果表明,纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性.本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体,为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础.