水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立

试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系.通过比较慢病毒(lentivirus)感染水牛颗粒细胞(buffalo granulosa cell,BuGC)、水牛乳腺上皮细胞(buffalo mammary epithelial cell,BuMEC)、水牛成纤维细胞(buffalo fibroblast cell,BuFC)的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数(MOI).分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC.将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度.将慢病毒按不同的感染复数(100、200、400、600、800)感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度.慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选.结果 显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为:BuM EC＞BuGC＞BuFC.在MOI=100时,慢病毒感染效率为:BuGC＞BuMEC＞BuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100％;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100％.不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)过表达慢病毒稳转细胞株.慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株.本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型.