检测猪弓形虫ROP14抗体间接ELISA方法的建立

为丰富和完善弓形虫病的检测方法,本试验基于弓形虫棒状体蛋白14 (TgROP14)建立了间接ELISA检测方法.构建原核表达栽体pET30α-ROP14,转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达并纯化获得TgROP14重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot试验验证其纯度及免疫原性.利用纯化透析后复性的rTg-ROP14建立猪弓形虫病间接ELISA检测方法,并对反应中各项条件进行了优化.结果 表明最佳检测条件为:抗原包被量2μg/孔,血清稀释倍数为1∶20,封闭剂为5％脱脂奶粉,血清作用时间为60 min,二抗稀释倍数为1∶1 000,二抗作用时间为60 min,TMB作用时间为20 min,临界值为0.728.该方法敏感性为1∶80,批内批间重复试验变异系数均小于10％,重复性较好;使用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征(美洲型)阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清、猪A型口蹄疫阳性血清和猪瘟阳性血清均未见交叉反应,特异性较好.利用该方法对来自浙江省各个地区的436份猪血清样品进行检测,同时使用商品化的间接血凝试剂盒进行验证,符合率为72.7％(317/436).综上所述,本试验建立的间接ELISA方法可用于临床样品的检测,为猪弓形虫病的血清流行病学调查提供了依据.