大肠杆菌cpxR和hns双基因缺失株的构建

为构建调节蛋白H-NS及双组分信号转导系统CpxAR的单、双基因缺失株,本研究以大肠杆菌ATCC25922为研究对象,以pKD4质粒为模板,分别扩增出含kanr基因的线性打靶片段,在pKD46质粒的辅助及L-阿拉伯糖的诱导下进行Red同源重组,使线性打靶片段替换大肠杆菌ATCC25922中的cpxR、hns基因,再用pCP20质粒消除FRT位点间的kanr基因,构建单基因缺失株△cpxR和△hns.接着以△cpxR为研究对象,用同样方法敲除hns基因,构建双基因缺失株△cpxR△hns.最后将重组表达质粒cpxR-pBAD/HisA、hns-pBAD/HisA电转入上述3种缺失株中,制备回补菌株△cpxR /pcpxR、△hns/phns、△cpxR△hns/pcpxR和△cpxR△hns/phns.结果 表明,利用该重组系统成功敲除了大肠杆菌ATCC25922中cpxR、hns基因,构建了单、双基因缺失株△cpxR、△hns和△cpxR△hns以及它们的回补菌株,为研究H-NS及CpxAR互作调控IncFⅡ质粒接合作用的分子机制提供了有力的工具.