弓形虫MIC10基因敲除株的构建及鉴定
Chinese Journal of Veterinary Science（2019）
摘要
为了解弓形虫MIC10基因特性,利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫MIC10基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶药物筛选、GFP绿色荧光观察及96孔板筛选阳性敲除虫株,并进行体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因进一步确定单克隆敲除虫株.结果 表明,加入乙胺嘧啶后MIC10基因敲除株能够正常生长,在荧光显微镜下观察敲除株呈现绿色荧光,在96孔板的单孔中筛选出唯一绿色荧光虫体;经体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因,敲除虫株扩增出1 000 bp的外源片段,未扩增出MIC10基因片段,而在对照组RH虫株扩增出263 bp MIC10基因片段,未扩增出1 000 bp外源片段;说明本试验成功构建并筛选出MIC10基因敲除的单克隆虫株,暂命名为弓形虫KO-MIC10-RH.本试验为弓形虫MIC10基因敲除株的致病性研究奠定基础.
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