牛骨髓间充质干细胞体外培养体系的优化

结合红细胞裂解法和全骨髓细胞贴壁培养法分离获得胎牛骨髓MSCs (bBMSCs),经贴壁培养、传代纯化后对其生物学特性进行检测,进而设定不同浓度胎牛血清-血清替代物(FBS-KSR)组合培养基(10％ FBS、5％FBS+5％KSR、2.5％FBS+7.5％KSR、10％KSR),对第5代bBMSCs进行体外培养,并对其增殖、多能性及凋亡情况进行检测.结果显示:原代bBMSCs具有贴壁特性,呈成纤维样细胞形态,表达MSCs相关标记分子CD73、CD90、CD105,不表达相关阴性分子标记CD45、CD34;体外具有成脂及成骨分化潜能,生长曲线呈典型的“S”型.CCK8检测显示,5％和7.5％的KSR可作为FBS的替代品,对bBMSCs体外增殖有显著促进作用.荧光定量PCR结果显示:添加不同浓度KSR后增殖相关基因bFGF mRNA水平显著升高(P＜0.01),进一步证明KSR可以提高bBMSCs的增殖能力;多能性相关基因检测显示,添加KSR组中Oct4、Sox2 mRNA表达水平也显著上调;凋亡相关基因检测显示,5％FBS+5％KSR组中抗凋亡基因Bcl2 mRNA水平显著上调,而2.5％FBS+7.5％KSR组中Bcl2表达显著下降而促凋亡基因Bax mRNA水平显著提高.推测这是由于细胞传代培养1周时,各组中细胞可能处于生长周期的不同时期,5％ FBS+5％KSR和2.5 ％FBS+7.5％KSR组中细胞已到达平台期,发生生长抑制,需及时传代,而10％FBS组中细胞仍处于对数生长期,未发生细胞凋亡.这也进一步说明,适当浓度KSR缩短了bBMSCs体外增殖周期,提高了细胞的增殖效率.结果表明:培养基中适当添加KSR有利于bBMSCs的体外扩增和多能性维持,同时需注意根据增殖周期变化调整传代时间,这对进一步优化牛及其他动物BMSCs的体外培养条件具有借鉴意义.