猪肺泡/羊水表面活性蛋白A的分离纯化及抗菌和抗病毒活性的分析

为探讨猪肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的抗菌和抗病毒活性,需要从猪肺泡液和羊水中分离纯化SP-A.首先通过化学交联法将麦芽糖共价交联在Sepharose胶粒上,制成能够与SP-A结合的胶粒,即麦芽糖-Sepharose(MS).采集肺泡灌洗液(BLAF)和羊水(AF),以11 000 r/min转速离心40 min获得富含SP-A的沉淀;将沉淀溶解于含8 mol/L尿素的缓冲液Ⅰ中使SP-A变性,再以无尿素的缓冲液Ⅰ透析使其复性.然后在含Ca2+的结合缓冲液中用MS吸附SP-A,用含EDTA的洗脱液洗脱,洗脱的SP-A过SephadexG-75凝胶柱得到纯化的SP-A.SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示:在相对分子质量为35 000和70 000处出现特异的SP-A蛋白带(或杂交带).菌体凝集试验显示:SP-A具有凝集E.coli的作用,表明制备的SP-A具有生物活性.抑菌试验证实SP-A对致病性E.coli、肠沙门杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的增殖均有不同程度的抑制作用,特别是对E.coli和肠沙门杆菌抑制作用更为明显.抗病毒检测结果显示:SP-A可明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在MARC-145细胞中的增殖,同时对猪细小病毒(PPV)在PK-15细胞中的增殖也有一定的抑制作用.结果表明:制备的猪SP-A在体外具有明显的抗菌和抗病毒活性,这为以后进一步研究猪SP-A的生物学特性及抗菌、抗病毒活性提供了必要的条件.