鸭疫里默菌环介导等温扩增检测方法的建立

采用对应于鸭疫里默菌16S rRNA基因442～461 bp序列的5条特异引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)反应体系,加入试剂盒提取的鸭疫里默菌DNA后,置63℃反应60 min,通过监测反应液浊度判断结果.在此基础上,用煮沸10 min的方法代替试剂盒提取DNA方法,并用显色方法代替浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果,通过敏感性、特异性、病原消长规律试验验证方法的准确性.另外,对临床采集的135只患病鸭的心血、脑组织、肝脏和心脏共540份样品提取DNA后,用LAMP和PCR进行检测,同时进行细菌分离和鉴定,比较各种方法检测结果的符合率.结果显示,菌液提取DNA后,LAMP和PCR方法最低分别可检测到2和10个CFU的鸭疫里默菌.菌液煮沸代替试剂盒提取DNA方法,使LAMP的敏感性降低5倍.显色法、浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果的敏感性和特异性相同.细菌分离法共获得201株鸭疫里默菌,且经LAMP与PCR法检测均呈阳性,LAMP与PCR法检出阳性样本总数分别为271和254份,LAMP方法阳性检出率高于PCR方法.建立的鸭疫里默菌LAMP检测方法具有较高的敏感性,进一步用菌液煮沸方法代替DNA提取法虽然使敏感性降低5倍,但节省了DNA提取步骤,再结合显色技术使反应结果直观可见,使其临床应用更加便捷.