犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒(CPV-VLPs),采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果.以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性.结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95％以上;优化的ELISA最佳工作条件为:纯化抗原包被浓度为5.0 mg/L,4℃包被过夜;1％ BSA,37℃封闭2h;待检血清1:40稀释,37℃孵育1.5 h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1 h;TMB室温避光显色30 min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264.该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应.该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6％,批间重复试验变异系数小于8％.42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48％.