干扰和稳定表达GP5对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染早期复制的影响

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要结构蛋白GP5对病毒复制的影响及其机制,利用PiggyBac Transposon载体系统构建表达GP5的重组质粒(pPB-GP5),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,获得稳定表达GP5的Marc-145细胞,在确定GP5表达不影响细胞增殖的基础上,用PRRSV感染筛选的细胞,通过 N基因拷贝数、N蛋白表达水平和病毒滴度检测确定GP5表达对病毒复制的影响,并采用 ELISA 方法检测培养上清中 IFN-α 、IFN-β 、IFN-γ 的水平;进一步针对PRRSV ORF5编码区设计合成3对特异性siRNA,转染Marc-145细胞6和12 h后以0.1 MOI病毒感染细胞,感染后24 h收集细胞,采用荧光定量PCR(qPCR)检测 GP5 mRNA的表达,采用Western blot 检测PRRSV N蛋白的表达.结果显示:经RT-PCR 、Western blot和IFA检测,确定GP5在Marc-145细胞中获得稳定表达,且不影响细胞增殖,但可以在感染早期促进PRRSV在细胞中的复制,这种促进作用可能是通过下调IFN的表达发挥的;与阴性对照siRNA 相比,3对特异性 siRNA均能抑制PRRSV复制,其中100 nmol·L －1的 siRNA GP5-471的抑制效果最好.研究表明GP5在PRRSV复制中发挥着重要作用.