施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立

拟建立施马伦贝格病毒(SBV)S基因焦磷酸测序检测方法,用于施马伦贝格病毒病的快速检测和确诊.通过对公开发表的SBV S基因序列与布尼病毒科其他11种病毒S基因进行比对,找出不同病毒变异区域集中且变异区域两侧保守的序列片段,基因合成,体外转录,作为基因扩增模板.在特异性变异序列两端的保守区域设计扩增引物,进行RT-PCR扩增.在保守区域设计双向测序引物,对RT-PCR产物进行双向焦磷酸测序.通过比对测序结果,确定是否为SBV核酸序列;优化条件,确定检测方法的敏感性、特异性和重复性,建立SBV S基因焦磷酸测序检测方法.结果:建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为166 bp;敏感性为可检测到104个拷贝;每一条测序引物可准确测出50 bp左右核酸序列,双向测序可准确测出100 bp左右核酸序列,具有较好特异性,完全满足施马伦贝格病毒病确诊要求;重复测序3次,均能准确测出100 bp左右核酸序列.本研究建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法,可用于施马伦贝格病毒病的检测和确诊,整个检测过程可在1d内完成,大大缩短了确诊时间.