霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

DncV (VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶,其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和c-GAMP.研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使,通过STING信号通路激活先天性免疫应答.为了体外制备c-di-GMP用于深入研究其功能,构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体,并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中.利用丙酸钠诱导表达后,观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达.超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达.最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质,获得的重组蛋白质进行体外酶促反应,高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP.结果表明:成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质.该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP.本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法;c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础.