单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌.李斯特菌溶血素 O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析.以单增李斯特菌 EGD-e 为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500 bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段.经Bam HⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒 pKSV7 中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得 hly 基因缺失株△hly.同时,设计引物扩增含 hly 基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒 pSL251,测序验证后电转至缺失株△hly 感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株C△hly.测序结果显示,缺失株△hly 和回补株 C△hly 均构建正确.利用 Western blot 方法检测突变株中LLO 的表达情况,结果显示EGD-e和C△hly中均能检测到 LLO 的正常表达,而△hly 中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO 在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础.