敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-Ⅰ基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用.本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-Ⅰ基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC 19-RIG-Ⅰ-sgRNA1和pUC 19-RIG-Ⅰ-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-Ⅰ敲除情况.PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-Ⅰ及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平.结果 显示,筛选出的1株RIG-Ⅰ基因缺失37bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-Ⅰ蛋白不表达.PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-Ⅰ mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-Ⅰ.敲除RIG-Ⅰ基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-Ⅰ信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制.本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型.