新城疫P蛋白磷酸化位点的质谱分析和功能鉴定

副黏病毒磷蛋白,即P蛋白(phosphoprotein),富含丝氨酸和苏氨酸,在自然条件下磷酸化水平较高.副黏病毒P蛋白的磷酸化对病毒的转录和复制具有重要的作用,但新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P蛋白磷酸化位点及其功能依然尚不明确.本研究通过LC-MS/MS质谱对NDV La Sota病毒P蛋白的磷酸化位点进行了检测,鉴定了Ser56、Ser77、Thr78、Thr82、Ser164和Ser141六个磷酸化位点.通过在线分析,预测这些磷酸化位点的磷酸化激酶分别是PKC、CKII和GSK3.为了鉴定6个磷酸化位点的生物学功能,在已建立的表达GFP基因的NDV微型基因组质粒pTVT-LGT基础上,用荧光素酶报告基因(luciferase)替换GFP报告基因,建立了表达荧光素酶的NDV微型基因组系统.利用“丙氨酸扫描”对6个磷酸化位点进行突变后,在NDV微型基因组平台中进行功能鉴定.结果 显示,T78、T82和S164位磷酸化位点的缺失显著影响了病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合体(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)的复制,其生物学意义有待进一步的研究.