蒙古绵羊内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与囊膜蛋白的表达分析

为了克隆内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)全基因组序列,针对env基因分析其结构并构建原核表达质粒,并诱导囊膜蛋白表达.根据GenBank中提供的enJSRV DNA序列(AF152615)设计引物,采用PCR方法进行序列扩增并克隆,并对克隆结果进行测序和生物信息学分析.然后将添加了BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的env基因片段克隆至pET-32a载体构建表达质粒,并将质粒转化至大肠杆菌(E.coli) BL21 (DE3)中诱导囊膜蛋白表达,最后利用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测、鉴定囊膜蛋白.结果显示,enJSRV序列长7 382 bp,其中env基因片段长1 836 bp,enJSRV与enJSRV-23的同源性为97.3％.PSORT Ⅱ及DNAStar等软件预测分析enJSRV囊膜蛋白主要定位于细胞质、线粒体内膜等位置,且存在多个抗原表位.在37℃条件下,0.5 mmol/L IPTG诱导转入pET32-Env的Ecoil BL21 (DE3),8h后可获得分子质量约为89 ku的以包涵体形式存在的囊膜蛋白.本试验测定了enJSRV全基因序列,并成功构建了表达囊膜蛋白的pET32a-Env载体,为今后制备enJSRV-Env抗体奠定了试验基础,同时为囊膜蛋白生物学功能的深入探讨提供了理论参考.