猪腹泻病毒可视化基因芯片的两种靶基因标记技术的比较

本研究同时采用常规PCR和不对称PCR分别进行靶基因片段生物素标记,应用于金标银染可视化基因芯片,分析其对猪腹泻病毒可视化共检基因芯片杂交效率的影响.分别选取猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(group A porcine rotavirus,GAR)的VP7和NSP4基因设计引物.根据目的基因片段设计60-mer寡核苷酸探针,在其5'端修饰15个T碱基后,利用芯片点样仪喷样于醛基玻片上制成基因芯片.应用常规PCR和不对称PCR两种生物素标记方法,对本实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,在相同条件下与基因芯片进行杂交.利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,将链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过银离子染色后直接眼观试验结果.结果表明,应用此可视化共检芯片特异性好,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV杂交结果均呈阴性.不对称PCR标记法可有效提高杂交效率,不对称PCR标记技术和常规PCR标记技术的最低检测浓度分别为105 copies/μL和107copies/μL,前者的灵敏性是后者的10～100倍.应用不对称PCR标记技术对样品进行生物素标记后,可明显提高腹泻病毒可视化共检芯片的杂交效率,有利于检测型可视化基因芯片的应用.