坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测坦布苏病毒的SYBR Green Ⅰ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒.重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR Green Ⅰ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r2＞0.999),平均试验间变异系数为0.26％;检测敏感性可达到2×101 copies/μL.应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97％.结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测.