小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中.对经鉴定的重组质粒pMD-Gh-relin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上.重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达.采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平.结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P＜0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P＜0.05或＜0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P＜0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P＞0.05).qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc (P＜0.05)、E2F1、CDK2(P＜0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P＜0.05).以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡.