大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素快速检测方法的建立与应用

为了建立新型、快速的大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)的检测方法,试验采用LT-Ⅱ家族的保守序列设计交叉引物等温扩增技术(cross priming amplification,CPA)和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,分别对这两种方法的反应温度、Bst聚合酶浓度和扩增时间进行优化,进一步对反应的特异性和敏感性进行研究,最后用这两种方法检测156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本,并以实时荧光定量PCR方法作为参照进行对比.结果 表明:建立的LAMP和CPA方法对LT-Ⅱ基因具有很好的特异性,LAMP和CPA方法的最低检出限分别为6.7× 102cfu/mL和6.7× 101cfu/mL,CPA法具有更高的敏感性.对156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本的检出率为7.7％(12/156),CPA、LAMP和实时荧光定量PCR三种检测方法的一致性为100％.说明建立的CPA方法不仅具有较高的特异性和敏感性,且不需要昂贵的仪器即能在短时间内完成靶基因的检测.