日本乙型脑炎病毒NS5rdrp蛋白的真核表达及鉴定

为了探究日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机理和研制以JEV复制复合体为靶标的药物,试验以GenBank中收录的JEV HW1株基因序列为模板,设计针对NS5rdrp的特异性引物,提取JEV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板使用PCR方法克隆得到NS5rdrp基因片段;利用T4DNA连接酶构建重组质粒pcDNA3.1-NS5rdrp,并对产物测序;提取去除内毒素的重组质粒,用转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染BHK21细胞,转染24 h后观察结果;最后利用Western-blot技术检测NS5rarp蛋白的表达情况.结果 表明:PCR扩增得到大小约为920 bp的NS5rdrp基因片段;测序结果经NCBI上BLAST比对分析,克隆得到的NS5rdrp基因与HW1株的同源性为100％;转染时细胞的最佳密度区间为70％～ 80％,转染试剂与转染质粒的比例为3∶1;经过Western-blot检测,重组质粒在细胞内正常表达,NS5rdrp蛋白的分子质量约为37 ku.说明试验通过真核表达成功获得NS5rdrp蛋白.