猪β2-AR第二细胞外环基因原核表达载体的构建

为了研制新型猪β2-受体激动剂,试验利用PCR扩增猪β2-肾上腺素能受体(β2-AR)的编码区基因序列并进行测序,用TMHMM软件对猪β2-AR蛋白质进行跨膜区段分析,找出第二细胞外环的DNA序列并进行大肠杆菌偏好性密码子优化,设计一段含两拷贝第二细胞外环的优化DNA序列,然后通过基因合成技术合成这段DNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-32a,再将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,最后提取重组质粒进行双酶切及测序鉴定.结果 表明:PCR扩增得到1 277 bp的β2-AR全基因序列,其中包含一个1 257 bp的开放阅读框,编码418个氨基酸残基;蛋白跨膜区段分析显示其第二细胞外环(pβ2-AR-EⅡ)位于第170～200位氨基酸,由93对碱基编码;设计并合成的DNA序列(D-EⅡ)共201 bp;构建的重组质粒pET-32a-D-EⅡ经双酶切后得到两条预期大小的片段,测序显示插入序列与D-EⅡ序列一致.说明猪β2-AR第二细胞外环基因原核表达载体构建成功.