鲤鱼PLA2g3a1催化活性区的原核表达及酶活性分析

[目的]本文旨在获得可溶的鲤鱼(Cyprinus carpio)groupⅢ分泌型磷脂酶A2(PLA2g3a1)催化活性区(PLA2 bee venom like region,PBVR)原核重组蛋白,并测定该蛋白的磷脂酶活性.[方法]分别构建标签蛋白小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)、硫氧还原蛋白(thioredoxin A,TrxA)、N利用物质A(N-utilization substance A,NusA)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)与PBVR的重组表达质粒,转化入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)进行原核表达,比较不同标签蛋白的促溶作用;使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,与BSA蛋白标准品电泳比对确定纯化后蛋白的浓度;采用偶联氧脂合酶法测定PBVR重组蛋白的磷脂酶活性.[结果]促溶作用最高的标签蛋白是NusA,可溶性重组蛋白占总蛋白的95％,其次是MBP和TrxA,分别占87％和47％.综合考量可溶性重组蛋白的得率,选择MBP融合蛋白.重组原核表达蛋白MBP-PBVR的磷脂酶比活力[(13.68±0.12)U·μmol-1]显著高于TrxA-PBVR[(0.94±0.01)U·μmol-1]和NusA-PBVR[(0.93±0.04)U·μmol-1](P<0.05).MBP-PBVR酶促反应最适pH值为7.5,在鲤鱼适宜生长温度(20～30℃)内酶活性无差异,微量Ca2+即能显著提高MBP-PBVR的磷脂酶活性,Kd为0.0153 mmol·L-1;MBP-PBVR磷脂酶的米氏方程参数Vm为2.2μmol·L-1·min-1,Km为31.9μmol·L-1.[结论]获得了可溶的具有磷脂酶活性的原核重组表达蛋白PBVR,揭示了MBP-PBVR磷脂酶活性特征.