甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高梁木质素提供一定的理论依据.搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析.实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高梁4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量.结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因.序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90％左右的相似度;它们可分为4CL Class Ⅰ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07 G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CLClass Ⅰ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ.酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力.通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL Class Ⅰ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加.在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07 G007810基因的表达量最高.上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因.