PRRSV N与GP5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础.[方法]将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测.用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45份猪血清样品进行检测,计算其符合率.[结果]SDs-PAGE和Western Blot分析表明,表达的目的蛋白分子质量约为24.7 ku,具有良好的生物学活性,且为可溶性表达.目的蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA平板,建立检测PRRSV抗体的间接ELlSA方法,优化后的ELISA条件为:抗原(纯化后的目的蛋白)包被量为5μg/mL、一抗(猪血清)1∶80稀释、酶标二抗1∶5 000稀释,以含50 g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃孵育60 min,抗体(一抗和酶标二抗)于37℃孵育90 min,TMB避光显色8 min;间接ELISA的判定标准为:OD450≥0.345 2为阳性,OD450＜0.345 2为阴性.所建立的间接ELISA方法特异性强,对猪常见病原,如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒高免血清检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为1.02％～3.94％和1.38％～4.83％.用所建立的间接ELISA方法对临床送检45份猪血清样品的检测阳性率为84.44％ (38/45),商品化IDEXX试剂盒检测的阳性率为80％ (36/45),2种方法的符合率为94.73％(36/38).[结论]成功建立了基于N与GP5蛋白抗原表位串联的PRRSV抗体ELISA检测方法.