霉菌实时荧光核酸恒温扩增检测技术研究

以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物,合成分子信标探针;以黑曲霉菌ATCC(16404)DNA为模板,通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA,进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplifica-tion and testing,SAT),并对体系内相应成分进行优化;最后利用优化的SAT体系检测食品污染中常见的病原微生物,评价SAT方法的特异性;针对不同浓度的黑曲霉菌孢子悬液,提取RNA进行SAT检测,评价SAT方法的灵敏性.结果表明,SAT检测体系中引物浓度为10μmol·L-1及探针浓度为10μmol·L-1时,反应曲线最佳;扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与培养的黑曲霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-7.061x+59.567,R2=0.9611),该方法的灵敏度为103个·mL-1孢子,用该方法检测食品中常见污染菌,发现仅黑曲霉菌出现荧光信号.初步建立了黑曲霉菌的SAT检测体系,可与食品常见污染细菌相鉴别,特异性达100％,进一步提高灵敏度后,可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法.