基于二代测序的甘蓝型油菜白花基因候选区间定位及连锁标记验证

[目的]近几年随着观光农业的兴起,花色的选育和改良已成为甘蓝型油菜种质资源鉴定和材料创制的重要研究方向.以甘蓝型油菜黄白花分离F2群体为研究对象,通过二代测序技术,对白花性状基因候选区间定位,开发与白花性状连锁的分子标记,为定位白花候选基因和选育白花新材料提供新思路.[方法]以甘蓝型油菜DH纯系黄花Y05和甘蓝型油菜纯系白花W01杂交,观察F1和F2群体的花色分离,分析白花性状遗传模式.在F2群体中选取30株纯白花和30株纯黄花构建DNA叶片子代池和RNA花瓣子代池,对亲本和DNA叶片子代池进行30×重测序,对RNA花瓣子代池进行5×测序.以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh、中双11、Darmor、Tapidor为参考序列,重测序QTL-seq分析流程计算2个DNA子代池的SNP-index和delta(SNP-index).利用R包画出SNP-index和delta (SNP-index)滑窗分析图,鉴定候选区间.转录组MMAPPR分析流程以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh为参考序列,计算SNP频率,ED4 (Loess fit)检测峰值和鉴定候选区间.利用MISA进行重复序列鉴定,使用Prime3在候选区间进行SSR引物设计,在F2群体中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对SSR引物进行筛选.[结果]甘蓝型油菜黄花与白花杂交F2群体中,白花和黄花性状分离比符合3∶1,暗示白花性状受1对显性主效基因控制.全基因组重测序区间定位结果显示,白花性状基因候选区间在Darmor-bzh C03染色体52-55 Mb.同时以甘蓝型油菜中双11、Darmor、Tapidor分别为参考序列,均鉴定出白花基因候选区间在C03染色体上的一致性和稳定性.转录组测序定位白花性状基因位于Darmor-bzh C03染色体54-55 Mb.转录组测序和重测序定位染色体结果高度一致.在此区间内MISA和Primer3结合设计SSR引物,聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选到6个与白花性状紧密连锁共分离的SSR标记.6个SSR标记区间范围在760 kb (52.81-53.57 Mb).此候选区间与甘蓝、白菜共线性分析,对应白菜A02染色体56.76-57.40 Mb区间,对应甘蓝C03染色体10.99-11.28 Mb区间.[结论]甘蓝型油菜白花性状由1对显性主效基因控制.白花性状基因候选区间在法国甘蓝型油菜Darmor-bzh C03染色体52-55 Mb区间内.此区间760 kb范围内筛选出6个与白花性状基因紧密连锁共分离的SSR标记.