紫花苜蓿MsWRKY42的分离、鉴定及其对非生物胁迫的响应

[目的]WRKY是转录因子大家族,在植物生长发育及逆境胁迫应答中发挥着核心调控作用.通过分析转录因子MsWRKY42在紫花苜蓿抗逆境过程中的作用,为进一步研究WRKY转录因子在紫花苜蓿抗逆分子调控中的作用奠定基础.[方法]通过同源比对方法从紫花苜蓿转录组基础数据库中获得MsWRKY42序列.使用MEGA-X对MsWRKY42蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对,构建系统发育树.通过PlantCARE预测分析MsWRKY42启动子的顺式作用元件.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析MsWRKY42在紫花苜蓿不同组织中的表达量及其在NaCl(0.3 mol·L-1)、PEG(15％)、4℃、40℃、低磷以及ABA(0.1×10-3 mol·L-1)处理后的表达量变化.构建pCAMBIA1300-WRKY-GFP融合表达载体,通过农杆菌转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana),确定MsWRKY42蛋白的亚细胞定位.利用酵母单杂交系统检测MsWRKY42和启动子区域顺式作用元件W-box的体外结合活性.[结果]该基因包含1个1692 bp的开放阅读框,编码563个氨基酸.多序列比对及系统进化树分析表明,该蛋白属于Ⅱb类WRKY家族成员,含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指基序,与拟南芥WRKY家族中的AtWRKY42相似度最高,故将其命名为MsWRKY42.在紫花苜蓿MsWRKY42启动子区域鉴定到多个顺式作用元件,主要包括胁迫响应、激素响应、生长发育等不同生命活动相关的调控作用元件.实时荧光定量PCR结果表明,MsWRKY42在紫花苜蓿各组织中均有不同程度的表达,其中根、叶中的表达量最高,茎、花、荚果中次之,芽中最低.经NaCl、PEG、低温、高温、低磷和ABA处理后的MsWRKY42表达量均有不同程度的上调.亚细胞定位结果显示,MsWRKY42蛋白定位在细胞核上.酵母单杂交系统检测结果显示,MsWRKY42能够与W-box顺式作用元件特异性结合.[结论]MsWRKY42为典型的WRKY转录因子,蛋白质定位在细胞核,能够与W-box顺式作用元件特异性结合;该基因在紫花苜蓿不同组织部位中均有表达,在根和叶中的表达量最高,且表达受NaCl、PEG、低温、高温胁迫和ABA激素的正向诱导.在紫花苜蓿中,该基因可能参与多种非生物胁迫反应.