灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径的关系

[目的]明确灰葡萄孢(Botrytis cinerea)犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径之间的关系,为进一步阐明BcKMO调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制打下基础.[方法]利用cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536,检测灰葡萄孢野生型BC22、BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO对cAMP信号途径特异性抑制剂的敏感性;分别提取灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO中的cAMP,利用HPLC检测各菌株中cAMP的含量;利用real-time PCR技术检测BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)的催化亚基基因pka1和pka2、调节亚基基因pkaR、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3在病菌不同发育阶段、组织部位以及培养条件下的表达规律;利用real-time PCR技术检测BcKMO突变体中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平;利用real-time PCR技术检测cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的RNAi突变中BcKMO的表达水平.[结果]灰葡萄孢BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183对cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536不敏感,受抑制的程度明显低于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO. BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP含量明显低于野生型菌株BC22和回复菌株BCG183/BcKMO. BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)的催化亚基基因pka1、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3的表达规律基本一致,均为在7d的菌丝和菌核中表达水平较高;此外,BcKMO和cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3均为在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高.BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平均明显高于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO. pka1、bcg2的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显高于野生型,而pka2、pkaR、bcg3的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显低于野生型.[结论]BcKMO负调控cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达;cAMP信号途径关键基因pka1、bcg2负调控BcKMO的表达,而cAMP信号途径关键基因pka2、pkaR、bcg3正调控BcKMO的表达.