枳NLP转录因子响应干旱胁迫并与NRE顺式作用元件互作

[目的]探讨枳氮素含量在干旱条件下的变化,以及氮代谢途径枳亚硝酸还原酶基因(NiR)和NLP转录因子的响应表达,分析确定枳NLP转录因子与NiR启动子区域硝酸盐响应顺式作用元件(nitrate-responsive cis-element,NRE)位点绑定互作.[方法]以一年生的砧木枳为试验材料,进行干旱处理直至植株叶片开始萎蔫,并设置对照.利用凯氏定氮仪检测干旱条件下枳叶片和侧根的全氮含量,并同步利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和2-△△CT法分析PtNiR、PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8在枳叶片和侧根的表达情况.通过基因克隆并检索与比对分析,获取PtNiR启动子区域的硝酸盐响应顺式作用元件序列,之后利用同源克隆方法构建用于酵母单杂交的pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec-NLP载体,将构建的pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec-NLP载体质粒共同转化到酵母菌株Y187中,在氨基酸缺失培养基(SD/-Trp/-Leu,以及SD/-Hi s/-Trp/-Leu/+120 mmo 1·L-1 3-氨基三唑)上30℃恒温培养3-5d,观察酵母的生长情况,以确定枳NLP转录因子(PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8)与NRE的互作关系.[结果]受干旱的影响,枳叶片全氮含量表现出先升高再下降的趋势,而侧根中全氮含量则显著下降;在对照中,枳叶片和侧根全氮含量均显著上升.RT-qPCR分析表明,PtNiR的表达水平在叶片中先上调然后再显著下调,而在侧根中则随着干旱程度的增加显著下调;PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7在枳叶片和侧根中的表达也均呈现不同程度的先上调然后再受到抑制的规律,而PtNLP8在枳叶片和侧根中的表达则在一定程度上受到干旱抑制.通过克隆测序分析,在枳NiR启动子区域-196至-154的位置发现了疑似NRE.酵母单杂交分析表明,转化pHIS2-4×NRE-HIS3载体和pGADT7-Rec-NLP载体的Y187酵母在对照培养基(-Trp/-Leu)和含有120 mmol·L-1 3-氨基三唑的三缺培养基(-His/-Trp/-Leu)上均能正常生长.[结论]枳侧根中的全氮含量受干旱的影响而显著下降,以对照为参比,枳侧根和叶片中的全氮含量均随着干旱时间的延长而相对减少.氮代谢途径的枳NiR和NLP转录因子在叶片和侧根中的表达对干旱有不同程度的响应.PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8转录因子均能与PtNiR启动子中的硝酸盐响应顺式作用元件(NRE)位点绑定互作,从而激活下游基因的表达.