应用锁式探针结合斑点杂交技术检测甜瓜细菌性叶斑病

[目的]甜瓜细菌性叶斑病是危害甜瓜的重要种传细菌病害,是由丁香假单胞杆菌流泪病致病变种甜瓜菌株(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)引起的.论文旨在建立高效、快捷、操作简单的检测技术以防止此病原菌传播.[方法]以GenBank公布的甜瓜细菌性叶斑病菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因序列为靶标,设计甜瓜细菌性叶斑病菌特异性锁式探针,建立锁式探针与斑点杂交技术结合的检测体系.以保存的目的菌株为材料,提取DNA作为模板进行锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,并将锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应的反应温度和反应时间分别进行优化.利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应分别对健康的甜瓜种子、带有甜瓜细菌性叶斑病的甜瓜种子、无菌水及25株其他参试菌株进行检测,测定该体系的特异性.将甜瓜细菌性叶斑病菌的DNA按10倍梯度稀释,依次稀释为1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1和1 fg·μL-1作为模板,利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,测定灵敏度.将探针与斑点杂交技术结合建立高通量检测体系,将上述反应过程中的扩增产物固定于尼龙膜上,将锁式探针上Zipcode序列的反向互补序列合成cZipcode(检测探针),检测探针(cZipcode)用地高辛标记后与产物进行杂交.锁式探针结合斑点杂交技术分别进行特异性检测和灵敏度测定.探针与斑点杂交技术结合建立的高通量检测体系进行人工模拟种子带菌检测,进一步验证该体系的可靠性.利用建立的高通量检测方法对205份市售疑似带病的甜瓜种子进行检测.[结果]锁式探针特异性测定结果表明,26株甜瓜细菌性叶斑病菌均能得到一条105 bp的特异性条带,而剩余25株参试菌株及无菌水均无扩增产物产生.灵敏度测定结果表明,当目的菌株的浓度稀释为1 pg·μL-1时均能检测到一条105 bp的特异性条带,所以探针的检测灵敏度为1 pg·μL-1.探针与斑点杂交技术结合建立的检测甜瓜细菌性叶斑病菌高通量体系能将甜瓜细菌性叶斑病与所有的参试菌种区分开,26株甜瓜细菌性叶斑病菌杂交后出现了显色反应,而25株参试菌株及无菌水均没有发生显色.锁式探针结合斑点杂交的灵敏度检测同样达到1 pg·μL-1.将锁式探针结合斑点杂交进行人工模拟种子带菌检测,能将1粒带菌种子从1000粒健康的种子检测出来,模拟种子带菌检测率都能达到0.1%(1/1000).从205份市售甜瓜种子中成功检测到7份市售种子带菌.将带菌种子分别加入一定量的无菌水浸泡4 h,提取悬液DNA,将悬液DNA进行PCR扩增后测序,NCBI比对后确定为甜瓜细菌性叶斑病菌.[结论]基于锁式探针结合斑点杂交技术的检测体系能够快速、准确地识别甜瓜细菌性叶斑病.