核糖体失活蛋白(α-MC)亚细胞定位及对TMV的抑制作用

[目的]克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况.研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应.[方法]根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP,用WolfPS0RT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和DsRed2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和DsRed2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果.利用qRT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1/PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理.[结果]克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp.Wolf PS0RT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上.共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和DsRed2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PS0RT预测的α-MC和PAP定位结果相一致.异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整.在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光.72h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的0D492比值几乎已达到处理组的1 0倍以上;qRT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;qRT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5-7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1/PR2的表达,从而引起更强的防御反应.[结论]异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性.研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据.