柑橘响应溃疡病菌转录因子CsBZIP40的克隆及功能分析

[目的]分析柑橘BZIP转录因子家族并克隆柑橘溃疡病菌相关的转录因子CsBZIP40,对其进行亚细胞定位并研究外源激素及机械损伤对该基因的诱导表达,确定其诱导表达模式,分析其与溃疡病菌侵染的关系.[方法]基于全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据染色体定位对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA 6.0分析柑橘BZIP与拟南芥BZIP的系统发育关系,并根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定本研究关注的CsBZIP40所属的类型;结合染色体定位和系统发育树确定该家族的基因复制情况;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法验证感染溃疡病菌前后由柑橘转录组筛选出的CsBZIP40表达模式;分析CsBZIP40、启动子元件(plantCARE)和核定位信号(cNLSmapper),构建GFP融合载体,用洋葱表皮进行亚细胞定位分析,来对预测的核定位信息进行验证;利用qRT-PCR技术分析水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ET)以及机械损伤(wounding)对该基因的诱导表达模式,揭示该转录因子与激素代谢途径的关系.[结果]从柑橘(甜橙)全基因组数据库中共注释到47个BZIP,这些BZIP基因位于9号染色体之外的所有染色体上,其中3号染色体基因密度最大为4.5× 10-2个/Mb,2号染色体上的BZIP基因密度最小,仅占所有BZIP基因的2％;柑橘BZIP基因家族含有较少的基因复制事件,所以相对其他已测序物种其BZIP家族较小;CsBZIP40基因全长5 756 bp,开放阅读框1 530 bp,编码509个氨基酸;经BZIP家族染色体定位、结构域和系统发育分析结果显示CsBZIP40基因序列特异性较好,且CsBZIP40与拟南芥中AT1g08320属于同源基因,属于柑橘1 0个亚家族中参与病菌防御的D亚类;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,例如Box-W1、HSE、ERE等;此基因含有核定位信号,亚细胞定位表明此蛋白定位于细胞核,具备转录因子发挥作用的前提;外源水杨酸并不会使四季橘和纽荷尔脐橙中CsBZIP40的表达水平显著上调,纽荷尔脐橙在茉莉酸甲酯诱导后有明显的差异表达,但乙烯利可以使CsBZIP40在四季橘和纽荷尔脐橙中均有较明显的差异表达;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因上调表达,而在感病品种纽荷尔脐橙中,该基因对柑橘溃疡病菌侵染没有响应.[结论]CsBZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个转录因子,该基因可作为柑橘抗溃疡病菌分子育种的一个候选基因来进行进一步功能性验证,具有潜在的分子育种价值.