褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响

[目的]研究褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1中胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响,探究褪黑素在mRNA水平对Gαi/o和Insulin1调节作用中可能存在的分子机制.褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,在机体内可调节胰岛素的分泌而使其呈现昼夜节律性分泌,影响葡萄糖昼夜代谢水平的变化进而维持机体血糖的相对恒定,故对于褪黑素影响胰岛素表达的研究可能会对褪黑素在胰岛素昼夜节律性分泌中的调控作用提供依据.[方法]将冻存的INS-1细胞复苏培养至第三代,INS-1细胞传代后,用RPMI1640培养基培养INS-1细胞约24—48 h,当细胞密度达60%—70%时,使用无血清无葡萄糖的RPMI1640洗2次,然后在INS-1细胞培养外液中分别加入不同浓度(0、10、20、30、50 mmol·L-1)的葡萄糖及100 nmol·L-1褪黑素和不同浓度葡萄糖孵育INS-1细胞12 h,观察和统计INS-1细胞的形态学变化.利用EasyPure?RNA Kit提取INS-1细胞的总RNA,核酸蛋白测定仪测定细胞总RNA的浓度和纯度,其次利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞的总RNA质量,TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录合成cDNA.利用Primer Premier 5.0引物设计软件,参考GenBank上已登录的基因序列进行Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCα 引物的设计.应用qRT-PCR法进行检测处理后的INS-1细胞Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCαmRNA水平的变化.[结果]用含不同浓度葡萄糖培养液孵育INS-1细胞后,观察发现随着培养基中葡萄糖浓度含量的增加INS-1细胞突触的增长呈现先增加后减少的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组INS-1细胞突触的增长明显,而20 mmol·L-1葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素处理组INS-1细胞表面积增大,但突触增长却不明显;培养基中含不同浓度葡萄糖的处理组中,Insulin1 mRNA水平呈现先升后降的趋势,Gαi1 mRNA水平则呈现先降后升的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组,Insulin1 mRNA水平显著增加(P<0.05),Gαi1 mRNA水平显著减少(P<0.05),而Gαi2和Gαo则无显著变化(P>0.05),因而Gαi1表现出与Insulin1 mRNA水平呈现负相关性而非Gαi2、Gαo与Insulin1 mRNA水平呈现负相关性;20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组和20 mmol·L-1葡萄糖处理组相比,20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组的Gαi1 mRNA水平显著增高(P<0.05),且Insulin1和PKCαmRNA水平显著减少(P<0.05),PKA mRNA水平则减少不显著(P>0.05).[结论]褪黑素能够抑制INS-1细胞Insulin1的表达,减少胰岛素的分泌导致INS-1细胞适应性增生.褪黑素与其受体结合后可促进Gαi1 mRNA水平增高而抑制PKCα 的表达,使得Insulin1的表达受到抑制,胰岛素分泌减少,使血糖在夜间得以维持相对恒定.