两种方法测定绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP21配体结合特性的结果比较

[目的]比较荧光竞争结合试验(fluorescence competitive binding assay)和微量热涌动(microscale thermophoresis,MST)技术在研究绿盲蝽(Apolygus lucorum)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)AlucOBP21配体结合特性上的差异,探索一种新的测定昆虫OBPs结合功能的方法.[方法]提取绿盲蝽雌、雄成虫触角总RNA并进行反转录,获得绿盲蝽成虫触角cDNA.采用特异性克隆引物,以绿盲蝽成虫触角cDNA为模板进行PCR扩增,构建pET32a/AlucOBP21重组质粒.将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,获得含表达标签的重组AlucOBP21蛋白.通过高亲和Ni-NTA纯化介质对重组粗蛋白进行纯化,采用重组肠激酶切掉His-tag标签,最终获得无表达标签的重组AlucOBP21蛋白.利用荧光竞争结合试验,以1-N-phenylnaphthylamine(1-NPN)为荧光探针研究重组AlucOBP21蛋白与候选配体的结合特性,其中1-NPN和气味标样均溶解在质谱纯级的甲醇中.同时,利用MST技术解析重组AlucOBP21蛋白与候选配体的结合特性,候选配体标样溶解在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液中.候选配体化合物包括8种潜在的盲蝽性信息素及性信息素类似物、12种植物绿叶挥发物和绿盲蝽驱避剂主要组分二甲基二硫醚等.[结果]重组AlucOBP21蛋白在上清液和包涵体均能够表达,最终选择上清组分进行目标蛋白纯化,利用重组肠激酶在22℃切除His-tag标签得到无标签的重组AlucOBP21蛋白.荧光竞争结合试验结果显示,重组AlucOBP21与荧光探针1-NPN的解离常数为(6.88±0.31)μmol·L-1,AlucOBP21能够与β-紫罗兰酮和β-石竹烯结合,解离常数分别为(13.74±1.93)和(13.24±2.12)μmol·L-1,而其他候选配体均不能与重组AlucOBP21有效结合.MST测试结果显示,AlucOBP21可以与β-石竹烯、β-紫罗兰酮、β-蒎烯和柠檬烯有效结合,解离常数分别为(0.20±0.02)、(0.05±0.01)、(0.70±0.04)和(0.40±0.06)μmol·L-1.其余候选配体化合物与AlucOBP21的热涌动不能随配体浓度变化而表现有规律的变化,故这些气味化合物不能与AlucOBP21发生结合作用.[结论]MST检测与荧光竞争结合试验相比,MST所得配体结合谱更广,不会遗漏一些结合力较弱的气味配体.