过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP（stress-associated protein）是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应，为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1，将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞，瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法，经组织培养获得转基因烟草进行异位表达，检测其与抗逆相关的生理指标，证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1ORF长度为543 bp，编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97，分子量19.3 kD，具有典型的 A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示，GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高，而在开花后5d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导，高盐处理2 h后表达量最高。利用含100μg·mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代，结合目标基因的PCR与RT-PCR验证，获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系，盐胁迫处理显示，发芽一周的种子在含200 mmol·L-1 NaCl培养基上胁迫12 d，转基因植株幼苗平均成活率为81.7%，比非转基因对照植株增加近3倍，其平均根长为3.05 cm，极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d，转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U·g-1 FW和8.37%，均显著高于非转基因对照；与未胁迫处理相比，转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg·g-1 FW，而非转基因对照降低了0.39 mg·g-1 FW；盐胁迫处理后，转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol·g-1FW，而非转基因对照增幅达20.85 nmol·g-1FW；在盐胁迫下，转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力，其地上部的K+/Na+为1.23，显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用，过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。