基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibactermichiganensissubsp. michiganensis， CMM），一直以来都受检测周期的限制，快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上，选择连接酶依赖的PCR扩增方式，并结合实时荧光PCR技术，旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法，为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列，设计锁式探针的T1和T2臂，使之与CMM的特异性片段碱基序列互补，再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时，先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接，再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针，最后以环化的锁式探针为模板，在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法，分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异，并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM，在供试的10种菌株中，只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性，空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加，检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法，其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高，DNA最低浓度检测为50 fg·μL-1，而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg·μL-1，灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测，结果显示，45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性，分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102），永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度，应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测，可以直接从番茄种子中检测到CMM，该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测，有较好的口岸检疫实际应用价值。