尖孢镰刀菌FoPLC4参与调控孢子形成和致病性

【目的】黄瓜枯萎病是黄瓜生产中的重要病害，其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusariumoxysporum f. sp. cucumerinum）。研究旨在明确尖孢镰刀菌黄瓜专化型编码磷脂酶C（phospholipase C，PLC）的FoPLC4在调控分生孢子形成和致病性等方面的功能。【方法】采用生物信息学方法，确定FoPLC4在染色体上的位置，分析 FoPLC4结构。基于尖孢镰刀菌番茄专化型基因组数据库，采用特异性引物克隆黄瓜枯萎病菌FoPLC4。根据同源重组原理构建携带潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase，HPH）基因的敲除载体，利用 PEG （polyethylene glycol）介导的方法转化原生质体，获得黄瓜枯萎病菌的敲除突变体?FoPLC4和遗传回复突变体?FoPLC4/plc4。转化子经潮霉素B平板筛选后通过PCR和RT-PCR分子验证。在PDA（potato dextrose agar）培养基上测定?FoPLC4生物学性状。利用分生孢子接种黄瓜胚根测定?FoPLC4在黄瓜幼苗上的致病性。【结果】FoPLC4位于尖孢镰刀菌基因组的4号染色体，DNA全长3282 bp，不含内含子，编码1093个氨基酸；FoPLC4含有5个结构域，包括EF手形（EF-hand）区、PH（pleckstrin homology）区、C2区和2个催化区，属于PLCδ亚型。与野生型菌株相比，?FoPLC4菌落生长速率没有显著改变，但气生菌丝较疏松；?FoPLC4可以同时产生大型分生孢子和小型分生孢子，大型分生孢子只占孢子总数的12.1%，而野生型菌株在相同条件下只能产生小型分生孢子，?FoPLC4产孢量下降了82.2%。致病性测定表明?FoPLC4在黄瓜幼苗上的萎蔫症状明显减轻，接种10 d后病情指数下降了53.3%。回复突变体?FoPLC4/plc4在菌落生长、产孢和致病性等性状与野生型相比没有显著差别。【结论】尖孢镰刀菌黄瓜专化型FoPLC4全长3282 bp，不含内含子，编码1093个氨基酸。与野生型相比，?FoPLC4分生孢子的产孢类型明显改变、产孢数量和对黄瓜幼苗的致病性显著降低。FoPLC4在调控尖孢镰刀菌分生孢子形成和致病性中发挥重要作用。