转基因水稻中GUS蛋白质的检测及其表达特征

建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法，并了解花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。以细菌基因组DNA为模板，PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体 pET30a 中，测序验证的重组子转入大肠杆菌表达菌 BL21中，IPTG 诱导获得重组表达的 GUS 蛋白质，用HIS-tag beads纯化后作为免疫原免疫小鼠制备GUS蛋白质特异的抗体，通过免疫印迹分析筛选高特异性的单克隆抗体，用Broadford法对重组的GUS蛋白质进行定量，对不同浓度的GUS蛋白质进行免疫印迹分析，绘制检测GUS 蛋白质的标准曲线，通过与标准曲线的比较对水稻叶片中 GUS 蛋白质进行定量分析。提取不同时期、不同部位的水稻总蛋白质，包括苗期的地上部、地下部，分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶枕、叶片上部、叶片中部和叶片下部，孕穗期的茎、穗轴、叶鞘、叶枕、叶片、幼穗（长度分别为1、2、10和20 cm），开花期的茎、穗轴、叶鞘、叶片、穗子，成熟期的茎、叶片、授粉后不同时期的种子（分别为授粉后10、20、30和40 d）、乳熟期的胚、胚乳和颖壳、成熟种子的全种子、胚、胚乳和颖壳以及不同时期的叶片和根部材料等。SDS-PAGE分离后用抗体检测其GUS蛋白质的丰度。筛选获得了高特异性的抗GUS单克隆抗体（编号为#27），用该抗体检测转基因水稻中及重组的GUS蛋白质均呈现特异条带，没有可见的背景信号，用本研究建立的免疫印迹方法对重组GUS蛋白质的检测下限约为4 ng，可检出转基因水稻单粒大米2.5%样品中（约0.6 mg）的GUS蛋白质。在不同时期的转基因水稻叶片中GUS蛋白质的表达丰度基本稳定，而在水稻根部的GUS丰度随生长急剧减少，5叶期根中的表达量不到3叶期的三分之一，到6叶期检测不到GUS蛋白质。在水稻苗期叶片中，GUS蛋白质约占鲜重的0.02‰。另外，除分蘖期以后的根部之外，GUS 蛋白质几乎在所有的水稻组织部位中呈组成型表达，只是不同组织中的表达量略有差异，如在孕穗期和开花期的茎及颖壳中的表达量较低。建立了具有应用价值的对转基因水稻中GUS 蛋白质丰度检测的免疫印记方法。该方法特异性高、样品用量少、不依赖于 GUS 蛋白质的酶活性、测定结果易于在不同实验室间比较。证明了35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中基本呈组成型表达。