小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法.根据GenBank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1830 bp H基因,构建标准质粒pMD-18-H.以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法.最优反应体系25μL:2×SYBR qPCR Mix 12.5μL,模板DNA 1μL,特异引物各0.2μL(0.2μmol/L),DEPC H2O 10.5μL;最佳反应条件:94℃2 min;94℃5 s,57℃30 s,40个循环,Ct值与标准质粒模板浓度在3.28×104～3.28×10-2 copies/μL 7个浓度梯度呈良好线性关系y=-2.913x+36.904,斜率为-2.913,扩增效率120.5％,相关系数R2=0.994.建立的实时荧光定量PCR检测方法比普通PCR灵敏度高10000倍,稳定性好,特异性强,对PPRV的准确诊断和定量检测具有重要意义.