利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究

为了构建敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因真核表达载体及单、共转染成纤维细胞后研究两基因表达量之间的变化,以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊.首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中DKK1、BMP4基因序列信息分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得DKK1、BMP4基因片段、利用SoSo试剂盒将目的片段连接到pcDNA3.1真核表达载体上.鉴定正确后的pcDNA3.1-DKK1、pcDNA3.1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3.1-DKK1、pcDNA3.1-BMP4单、共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测DKK1、BMP4基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化.结果显示,经酶切、测序鉴定pcDNA3.1-DKK1、pcDNA3.1-BMP4构建成功,成纤维细胞原代、传代培养良好,转染后细胞生长良好,经实时荧光定量PCR技术和Western Blot检测DKK1基因共转染成纤维细胞较单转染的表达量极显著下降(P<0.01),BMP4基因的共转染较单转染表达量没有发生明显变化.成功构建了敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因的真核表达载体,并且成功共转染成纤维细胞,DKK1基因的表达量明显下降,BMP4基因的表达量没发生明显变化,因而,推断BMP4基因抑制了DKK1基因的表达,DKK1基因对BMP4基因作用不明显,结果可为进一步研究其功能奠定基础.