基于花椒转录组序列SSR分子标记开发及花椒种质鉴定

为拓展分子标记在花椒种质资源分析中的应用、开发花椒EST-SSR功能性分子标记、分析花椒DNA指纹图谱,利用凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组cDNA数据库中45057条长度大于200 bp的非冗余Unigene序列,使用MIcroSAtellite(MISA)软件搜索SSR位点,分析花椒cDNA序列中SSR位点的频率和密度、SSR重复基元种类及比例、SSR重复次数与数量等分布特征;用Primer 3.0软件在线设计SSR引物并经PCR扩增筛选适合的多态性引物;用Quantity One软件统计多态性条带和分子量大小;NTsys 2.0软件分析12份花椒种质的遗传距离、构建树状聚类图及DNA指纹图谱库.结果表明,45057条序列中有3315条Unigene序列包含SSR位点,共3814个,3315条序列中SSR位点出现频率为7.07％;在检索出的SSR位点中,二核苷酸、三核苷酸是主要重复类型,分别占29.42％和58.58％,二核苷酸重复中以AG/TC、CT/GA出现频率最高,三核苷酸重复中GAA/CTT、AGA/TCT出现频率最高;二、三、四、五、六核苷酸重复基元总数随着重复次数的增加呈明显下降趋势.利用Primer 3.0设计的64对EST-SSR引物中,55对引物能产生预期片段大小的PCR产物,其中18对引物具有多态性;利用18对引物对12份花椒种质进行PCR扩增,共产生81条扩增条带,其中多态性条带73条,多态率为90.12％;各花椒种质的遗传相似系数为0.5526～0.8947,平均为0.7250;经UPGMA聚类分析在相似系数0.70处12份花椒种质共分为3类,即顶坛花椒为Ⅰ类、竹叶椒为Ⅱ类、其他花椒为Ⅲ类;指纹图谱分析中,8对引物在5份种质中能扩增出特征带型,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开.成功在凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组cDNA序列中开发SSR标记,设计并筛选出8对能扩增出特征带型的引物,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开,这为今后花椒遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面提供新的引物序列并奠定了基础.