花吊丝竹ISSR反应体系的建立与优化

建立关于花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系,为花吊丝竹种质资源鉴定提供理论基础.采用单因素试验法,对影响PCR扩增效果的Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行分析,并利用建立的优化反应体系和扩增程序对100条候选引物进行筛选.结果表明,适合花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系为:20 μL的反应液中含3.0 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、1.25 UTaq DNA聚合酶、0.6 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2μL 10×Buffer、8.55 μL ddH2O.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存.建立的花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系能够扩增出清晰、多态性较高的条带,且筛选出的16条引物具有高度多态性.表明该体系具有较高的稳定性、重现性和适用性.